尿道下裂是由于胚胎时期外生殖器发育异常、尿道板未能正常融合所致。目前尚不清楚其发病机制，可能是环境因素与基因相互作用的结果。
Parker等研究发现HoxA13基因突变多出现在手-足-生殖器畸形中，因而推测HOX基因可能与泌尿生殖系统畸形发生有关。本次实验主要是研究不同类型尿道下裂患儿尿道板及包皮中HoxA13基因转录及其蛋白表达，探讨其与尿道下裂严重程度的相关性，以期了解HoxA13在尿道下裂发生机制中的作用。
1资料和方法
1.1资料选择从2012年3～9月本院手术治疗的尿道下裂患儿30例，其中前型10例（阴茎头型3例、冠状沟型3例、冠状沟下型4例），中间型10例（阴茎远段型3例、阴茎中段型3例、阴茎近段型4例），后型10例（阴茎阴囊型4例、阴囊型3例、会阴型3例）。年龄在3.3～11.6岁，平均7.5岁，无其他泌尿生殖系畸形及其他系统的病变与畸形，所有入组病例此前均未接受手术或激素治疗。手术中取其背侧的包皮组织100～150mg与腹侧异位尿道口处尿道板约3mm。另选10例包茎患儿为正常对照，年龄3.1～10.4岁，平均6.8岁，收集其背侧包皮组织。10例阴茎癌患者取其尿道为正常对照，年龄48.1～75.6岁，平均61.9岁。将所得每份组织一式2份，分别置于液氮，多聚甲醛中保存。
1.2主要试剂与仪器总RNA提取试剂TRIzon，cDNA第一链合成试剂盒（美国ThermoScientific公司）；2×TaqMasterMix;兔抗人HoxA13多克隆抗体（美国SantaCruz公司）；羊抗兔IgG（武汉博士德公司）；DAB-H2O2显色试剂盒（武汉博士德公司）；ep-pendorf梯度PCR仪，UVP凝胶成像分析系统，O-lympus-PMTVC数码图像采集系统，Image-ProP1us4.1图像分析软件。
1.3实验方法
1.3.1RNA提取及cDNA合成取冻存组织50～80mg置于液氮预冷的无菌研钵中，按照TRIzol操作说明提取RNA，经核酸蛋白测定仪测定A260nm/A280nm比值与浓度并行RNA电泳，鉴定RNA纯度及完整性。取1μg总RNA进行逆转录，反应体系20μl，按照说明书操作，所得cDNA经核酸蛋白测定仪测定其浓度，并置于－20℃冻存备用。
1.3.2RT-PCR引物HoxA13，GAPDH由PrimerPrimer5序列应用软件设计，南京金斯瑞生物科技有限公司合成。反应体系15μl进行扩增。HoxA13上游：5'-AAATGTACTGCCCCAAAGAGCA-3'，下游：5'-ATCCGAGGGATGGGAGACC-3';GAPDH上游：5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'，下游：5'-CGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。反应条件：95℃15min;95℃30s;60℃30s;72℃1min;72℃7min。
1.3.3免疫组化
将4%多聚甲醛固定的组织进行常规石蜡包埋切片，切片厚5μm。经脱蜡、抗原修复，封闭，滴加兔抗多克隆HoxA13抗体（1∶200）于4℃孵育过夜，加羊抗兔IgG抗体、ABC、DAB-H2O2显色20min，电子显微镜观察。用已知阳性片作对照，PBS代替一抗作空白对照。
结果判定：按照细胞质有阳性着色即为阳性细胞进行分析，显微镜200倍放大拍照，Image-ProP1us4.1软件分析累计光密度（IA）。
1.4统计学分析
应用GraphPadPrism4软件进行统计学分析，计量资料用x&viewmn;s表示，多组均数比较采用Kruskal-WallisH检验，两两比较用Mann-WhitneyU检验。P≤0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1RT-PCR的特异性
PCR产物凝胶电泳显示目的条带与内参都只有一条，且分子大小符合，无其他杂带。
2.2包皮和尿道板中
HoxA13mRNA相对定量分析尿道下裂与对照组中都有HOXA13的转录，相对于内参的表达水平，对照组明显高于中型和后型，前型的表达水平也明显高于后型，见表1和图1。
图1 HoxA13 mRNA 在各类型尿道下裂中患者包皮与尿道板组织的表达
表1 包皮与尿道板中 HoxA13/GAPDH 的表达量
2.3包皮和尿道板中HoxA13蛋白的表达
光学显微镜下观察可见HoxA13蛋白定位表达于包皮表层，主要在基底层细胞中，阳性为胞质黄染，呈颗粒状。对照组包皮组织中HoxA13蛋白集中表达于表皮层尤其是在基底层细胞中，呈阳性或强阳性；而尿道下裂组中HoxA13蛋白散在或零星状分布于表皮层且呈阴性或弱阳性。对照组尿道组织中，HoxA13蛋白表达多、分布密集，多分布于尿道表皮分化成层状的鳞状表皮中的基底细胞。而在尿道下裂的尿道板中，HoxA13蛋白零星分布，主要表达于尿道板表皮分化成层状的鳞状表皮中的基底细胞，在移行细胞层里少有表达。移行细胞层鳞化的程度可能与尿道异位开口位置有关，位置越靠近尿道外口鳞化越多。对照组明显高于中型和后型，前型的表达水平也明显高于后型，见表2和图2～3。
表2 包皮和尿道板中 HoxA13 蛋白累计光密度
